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独脚金内酯的生物合成途径尚未完全阐明，目前已确定其中部分步骤以及各化学反应步骤所需的酶。 第一步是对β-胡萝卜素中第9个化学键进行异构化，生成9-顺式-胡萝卜素。6 这第一步是由β-胡萝卜素异构酶进行的，又称DWARF27或简称D27，其需要铁作为辅助因子。第二步中，9-顺式-胡萝卜素经由类胡萝卜素裂解脱氧酶 7 (CCD7) 催化，被分解为 9-顺式-胡萝卜醛和β -紫罗兰酮。 在第三步中，另一种类胡萝卜素裂解加氧酶，称为 CCD8（与 CCD7 来自同一家族），催化将上一步中产生的醛转化和重排为 9-顺式-β-阿朴-10' 胡萝卜醛，并随后产生卡拉内酯。目前尚不清楚卡拉内酯究竟是如何转化各种不同独脚金内酯的，但多项研究已经证明卡拉内酯是独脚金内酯的前体。 据推测，在生物合成的最后一步中，应该包括添加至少两个氧分子以将卡拉内酯转化为 5-脱氧独脚金醇，一种简单的独脚金内酯，而其他更复杂的独脚金内酯应该需要进一步氧化来产生。 有研究提出，MAX1蛋白在植物的氧化代谢中发挥的作用，其很有可能被用于催化独脚金内酯生物合成的最后一步。
脱落酸 (ABA) 和独脚金内酯的合成共用一组共同的酶，同时之前的多项研究也已经证实了这两种生物合成途径之间的相关性。ABA的生物合成依赖于一系列被称为9-顺式环氧类胡萝卜素脱氧酶(NCED)的酶。在某些存在NCED酶合成方面缺陷的突变植物体内，不仅能观察到过低的ABA水平，还出现了独脚金内酯水平的降低。 独脚金内酯水平的降低尤其体现在原本合成该激素的根部提取物中。这一发现表明，两种合成途径存在共用酶的机制，其他实验，包括使用无法检测生长素变化的突变体阻断NCED酶和，也支持这一理论，但到目前为止，这两种合成途径之间的确切连接机制仍不明确。
植物通常通过双受体/水解酶蛋白DWARF14(D14)感知体内独脚金内酯浓度。但尽管目前已提出了几种关于具体信号传导谢途径的推测，但真正的机制尚有待发掘。
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