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使用直立电泳组合时，由上（负极）至下（正极）的主要组成分别为缓冲液（Tris-Glycine，pH 8.3）→样本溶液（pH 6.8）→堆积层（Tris-HCl，pH 6.8）→分离层（Tris-HCl，pH 8.8）→缓冲液（Tris-Glycine，pH 8.3）。
样本在堆叠层电泳的过程中，会被压成一个薄层，再以相同的起始点，进入分离层。
堆积层含有4-5%的丙烯酰胺，这样堆积层的孔径就相对较大和松散。这一层的目的是让样品在堆积层和分离层的界面浓缩到一个超薄的区域（1-100nm）。当施加电压时，由于蛋白质外包裹着SDS，便使蛋白向正极迁移，由于这层的pH是6.8，甘氨酸在这里呈两性离子状态存在，所以这一层的离子强度便很低，从而形成高电阻,最终形成 高电场力 ,从而使蛋白质的在堆集层的迁移速率高于分离层。另外由于这层的孔径大，所以对一般蛋白质的迁移速率不造成影响；
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