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阿糖胞苷能够干扰DNA的合成，同时也是一种抗代谢物。它能够在人体内被deoxycytidine kinase迅速转化为三磷酸阿糖胞苷，其被认为是主要产生细胞毒性代谢物，会在细胞周期S期中，三磷酸阿糖胞苷会竞争性的去抑制DNA聚合酶 (包括DNA polymerase-α和DNA polymerase-β，前者的抑制效果影响到DNA的合成，后者则是影响到DNA的修复)。此外，三磷酸阿糖胞苷还会嵌合进RNA和DNA，干扰到长链的延长和新合成DNA的连接，其皆可达到细胞毒性的效果。所以，需要DNA的复制来进行有丝分裂的快速分裂的细胞（如癌细胞和骨髓细胞）受到的影响最大。阿糖胞苷还能够影响DNA聚合酶、RNA聚合酶及核苷酸还原酶这些DNA合成中的重要酶类的工作。
当用作抗病毒药物时，阿糖胞苷的机理是阻止脱氧胞苷的作用。
在人体内阿糖胞苷会迅速脱氨基化形成无药效的尿嘧啶衍生物，因此该药物通常以持续静脉注射的方式给药。
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